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    分析實時PCR實驗的步驟及注意事項

    發(fā)布時間： 2025-06-26　　點擊次數(shù)： 446次
    　　實時PCR實驗，也稱為實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），是一種在PCR擴增反應中加入熒光基團，通過實時監(jiān)測熒光信號積累來監(jiān)測每次PCR循環(huán)后產物總量，進而對待測樣品中的目的序列進行定量分析的方法。
    　　實時PCR實驗的原理是在PCR反應體系中加入熒光染料（如SYBR Green）或熒光探針（如TaqMan探針）。這些熒光物質可以與DNA雙鏈結合，并在PCR擴增過程中隨著DNA的增加而發(fā)出熒光信號。熒光信號的強度與PCR產物的量成正比，從而可以通過熒光信號強度來推算出目標DNA或RNA的起始濃度。
    　　實時PCR實驗的步驟：
    　　1、樣品準備：包括細胞總RNA提取、RNA濃度測定、反轉錄合成cDNA模板等步驟。
    　　2、配樣：按照實驗需要對cDNA模板加水作適當稀釋，渦旋混勻后離心，根據實際所檢測樣品和基因的數(shù)量計算加樣體系，加入ddH2O、qPCR mix、引物等，配成一管mix，渦旋混勻后離心。
    　　3、加模板：在每個孔各加入一定量的cDNA模板，加樣完畢后蓋上管蓋，渦旋混勻后離心，去除氣泡。
    　　4、上機反應：設置反應溫度、孔板信息等參數(shù)，將樣品放入儀器中開始反應。
    　　5、數(shù)據導出與分析：反應結束后得到qPCR數(shù)據，根據溶解曲線查看數(shù)據的有效性，導出數(shù)據為EXCEL文件并保存，進行進一步分析。
    　　實時PCR實驗的注意事項：
    　　1、防止污染：實驗過程中要嚴格遵守操作規(guī)程，防止擴增序列的殘留污染和樣品間的交叉污染。
    　　2、準確加樣：使用一次性吸頭，避免吸頭長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
    　　3、設立對照：操作時設立陰陽性對照和空白對照，以驗證PCR反應的可靠性和擴增系統(tǒng)的可信性。
    　　4、重復實驗：為了驗證結果的準確性，通常需要進行重復實驗。